近些年来,许多研究表明,一些不会翻译成蛋白质的非编码RNA同样在多种细胞活动中不可或缺。因此,理解RNA的功能和代谢就变得至关重要,而只有我们明确了RNA的生理功能,才可能在异常疾病状态下对其进行调控和纠正。

  然而,RNA具有动态多变的特点,它的分布也具有时间和空间的特异性,这也为研究RNA提出了更高的要求,需要找到一种技术可以对RNA进行精准地调控,从而了解其在细胞当中的功能。

  近日,华东理工大学杨弋教授团队研发出一种光控的RNA结合蛋白,这种蛋白会与RNA上特定序列结合,就像是安上了光敏开关,通过对光的调节就可以实现对RNA功能和代谢的改变。这项研究结果发表于《自然·生物技术》(Nature Biotechnology)上。本文第一作者陈显军告诉果壳:“我们的团队一直聚焦光遗传学技术的发展与应用,未来除了继续在这个领域深耕,我们也希望尽快推进技术的产业化

  如何实现用光调控蛋白与RNA的结合?

  LicV单体可在蓝光照射下形成二聚体,并与RNA结合 | 自然·生物技术[1],果壳作者汉化

  这种全新的光控RNA结合蛋白由两个核心模块组成:其一是从枯草杆菌中发现的转录抗终止蛋白的RNA结合结构域LicTCAT,在两个LiCTCAT发生二聚化时,就可以特异性地与核糖核抗终止RNA(RAT)序列结合,从而阻止RNA终止茎-环结构的形成;其二则是可以在蓝光的激活下迅速发生二聚化的Vivid蛋白(VVD)

  这两个核心模块赋予了LicTCAT-VVD融合蛋白可以在光的诱导下发生二聚化,从而增强其与RNA结合的能力,去掉光源则会出现蛋白二聚体及RNA与蛋白质的逐渐解离。研究者们以红色荧光蛋白作为报告基因,对LicTCAT和VVD之间含有不同连接子的融合蛋白进行测试,找到了蓝光照射和黑暗状态下具有最大荧光强度变化的融合蛋白,并把它命名为LicV

  不同应用场景下的效果如何?

  将不同效应蛋白与LicV结合获得的融合蛋白可在光控下影响RNA的代谢|自然·生物技术[1],果壳作者汉化

  既然蓝光可以调控LicV蛋白与含有RAT的RNA序列结合,那么这个系统是否可以对RNA的功能和代谢产生影响呢?研究者们将一系列具有不同功能的效应蛋白结构域与LicV融合在一起,测试蓝光能否让这些效应蛋白发挥相应的作用。

  细胞内定位是RNA发挥正常功能的基础。研究者们尝试将LicV与多种不同的亚细胞内定位的信号融合,在蓝光照射时含有RAT序列的RNA及其报告蛋白可在较短时间内出现与定位信号一致的亚细胞定位。而当恢复黑暗时,这种特异性的位置改变又会逐渐消失。

  DNA转录后去除内含子、合并外显子的剪接过程是形成编码RNA的重要步骤。将LicV分别与促进或阻碍外显子保留的剪接蛋白融合便形成了光控的剪接因子,给予光照后,即可使剪接报告RNA出现不同的剪接方式

  RNA翻译是生物产生蛋白质的基本方式。将LicV与翻译起始因子4E融合,蓝光照射下,报告蛋白的翻译显著增强,翻译的强度还会受到光照强度的影响。

  RNA完成功能后会发生降解。研究者们将LicV与一个小型RNA剪切模块barnase融合,在蓝光下与目标RNA的RAT茎-环结合,令其具有很强的剪切活性,但黑暗下,非特异的剪切活性可忽略不计。

  通过多种场景的尝试,科研团队发现LicV是一种可用范围广泛的光控RNA结合蛋白,通过将其与不同的效应蛋白的融合,就可达到在时间和空间上对RNA进行调控。陈显军告诉果壳,由于在一定范围内效应因子作用与光强呈正相关,并且VVD对蓝光区域的光最敏感,通过调节光强和波长,甚至可以达到对RNA的定量调节。

  强强联合

  近些年,CRISPR/Cas9系统的发展为生命科学研究带来了颠覆性的改变,它广泛地应用于基因组编辑、高通量的基因组功能筛选、活细胞成像等领域。Cas9蛋白在向导RNA的引导下对基因组内的目标位置进行精准定位。

  那么LicV是否可以与CRISPR联合使用呢?

  研究者们将RAT序列巧妙地与向导RNA结合,再将LicV蛋白与转录激活结构域VPR结合,研发出LA-CRISPR联合系统。在蓝光的照射下,被向导RNA定位的靶点基因的表达就会显著升高,既发挥了CRISPR系统的准确定位优势,又可以达到光控的效果。研究者们还将绿色荧光蛋白与LicV结合,通过LA-CRISPR实现了光控下的基因组位点的荧光标记。

  CRISPR技术存在一定程度的脱靶效应,即基因组当中一些非目标位置成为了CRISPR的作用靶点。那么,LA-CRISPR系统是否存在相同的技术问题呢?果壳从陈显军处得知,研究人员正在开展相关研究,以降低CRISPR的脱靶效应,从而达到对RNA的精准调控。

  应用前景

  这种光控RNA结合蛋白LicV的研发在一定程度上为研究RNA的功能打开了一扇崭新的大门。当下的研究中,对于RNA诱导性表达的调控往往通过药物进行,药物不仅对细胞存在潜在毒性,这种实验还仅能获得有关RNA表达单一调控方式的信息。

  陈显军还告诉果壳:“LicV是基于合成生物学设计理念构建,分别来自枯草杆菌(Bacillus subtilis)和粗糙脉孢菌(Neurospora crassa),它们与哺乳动物细胞组分是生物正交的,因此具有很好的生物安全性。”同时,LicV与不同的效应分子结合就可以对RNA定位、剪接、翻译、降解等多个过程进行精准改变

  此外,LicV系统的研发更是一种研发模式的开启,这种蛋白受到蓝光调节,或许未来研究者们还能找到对其他光谱范围敏感的受体蛋白。试想如果将不同颜色的光控蛋白转入细胞内,就可以实现通过不同的光照,同时对多种RNA进行调控的目标,为研究多种复杂生命活动提供了有效工具,扩充了生命科学研究的工具箱,使从事这类研究的科学家可以更充分全面地了解RNA的功能。

  “RNA是当下生物医药研究的前沿焦点,RNA除了参与细胞的几乎所有重要生命过程,其本身还可作为药物参与疾病的防治,如mRNA疫苗、干扰RNA等。因此,发展能够对这些RNA进行精密控制的方法将会极大促进RNA的功能解析以及基于RNA的生物医药领域的发展。”陈显军解释道,“基于LicV的RNA光遗传学技术可以让人们精确控制RNA的转录、剪接、定位、翻译、降解等代谢行为,相比较传统的方法,该方法具有极佳的可控性,其时间分辨率可达毫秒,而空间分辨率可达亚细胞尺寸,这使得它可避免治疗过当和治疗不足,有望真正实现精准医疗。”

  目前,研究者们正在开展将LicV应用到活体组织的实验,并已获得初步结果。尽管此项技术距离临床应用还有一段距离,但未来值得期待。

  致谢

  感谢华东理工大学杨弋课题组陈显军博士对本文的审阅和建议。

  参考文献

  [1] Liu, R。, Yang, J。, Yao, J。 et al。 Optogenetic control of RNA function and metabolism using engineered light-switchable RNA-binding proteins。 Nat Biotechnol (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41587-021-01112-1

  作者:郭怿暄

  研究团队

  通讯作者 杨弋:博士毕业于清华大学生物化学,毕业后赴美哈佛大学医学院进行金属硫蛋白的博士后研究工作。现任华东理工大学药学院及国家生物反应器工程重点实验室特聘教授,从事合成生物学与光遗传学前沿技术发展与应用研究。

  通讯作者 陈显军:博士毕业于华东理工大学药学院化学生物技术与工程专业。2015年开始从事华东理工大学药学博士后研究。华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室固定成员,研究方向为新型光遗传学技术的开发与应用及生物大分子荧光标记技术开发与应用。

  论文信息

  发布杂志 《自然·生物技术》nature biotechnology

  发布时间 2022年1月3日

  论文标题 

  Optogenetic control of RNA function and metabolism using engineered light-switchable RNA-binding proteins(DOI:10.1038/s41587-021-01112-1)

  本文转自果壳硬科技/我是科学家iScientist


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